Restriction Site DNA Sequencing

Restriction Site DNA Sequencing

A.    Pengantar

Enzim Restriksi

Enzim restriksi merupakan enzim yang dapat memotong molekul DNA pada sekuens spesifik yang pangjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa. Kerja enzim dalam tubuh inangnya adalah mengenali dan memotong DNA (termasuk DNA faga tertentu) yang asing bagi bakteri tersebut. Hal ini dilakukan sebagai mekanisme perlindungan bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain seperti virus atau sel bakteri lain. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong DNA pada lokasi-lokasi yang spesifik mengenali daerah atau urutan DNA pendek dalam molekul DNA dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat PALINDROME.

Selanjutnya enzim tersebut akan memotong DNA pada titik tertentu di dalam urutan DNA tersebut. Sel bakteri ini melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan menambahkan gugus metil (CH₃) pada adenine atau sitosindi dalam urutan yang dikenali oleh enzim restriksi. Enzim-enzim restriksi yang telah ditemukan dan telah tersedia secara komersial telah berjumlah ratusan. Ada tiga tipe enzim restriksi yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan. Hasil pemotongan enzim restriksi ada dua jenis. Hasil pemotongan yang menghasilkan ujung tumpul atau “Blunt end” dan hasil pemotongan yang menghasilkan ujung lancip/ lengket atau “Sticky end”.

Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi

endonuklease tipe I, II dan III

Salah satu contoh enzim restriksi adalah EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalagh GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Beberapa contoh enzim restriksi endonuklease dapat dilihat pada tabel di bawah ini.

Gambar 2. Macam-macam enzim restriksi endonuclease

Sekuensing DNA

Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik untuk menentukan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Sekuens DNA merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sejarah sekuensing DNA pada mulanya dilakukan dengan mentranskripsikannya ke dalam bentuk RNA terlebih dahulu karena metode Sequencing RNA telah ditemukan sebelumnya. Pada tahun 1965, Robert Holley dan timnya dari Cornell University di New York, Amerika Serikat, mempublikasikan sekuens tRNA alanin dari khamir yang terdiri atas 77 nukleotida. Sequencing tRNA tersebut membutuhkan waktu 7 tahun dan hasilnya merupakan sekuens molekul asam nukleat yang pertama kali dipublikasikan. Sekuens DNA yang pertama kali dipublikasikan adalah DNA sepanjang 12 nukleotida dari suatu virus, yaitu bakteriofag lambda, pada tahun 1971, yang ditentukan dengan cara serupa oleh Ray Wu dan Ellen Taylor, keduanya juga dari Cornell University.

Pada tahun 1975, Frederick Sanger dan Alan Coulson dari laboratorium biologi molekular Medical Research Council Inggris di Cambridge mempublikasikan metode Sequencing DNA secara langsung yang disebut teknik plus–minus. Pada tahun 1977  Allan Maxam dan Walter Gilbert di Amerika Serikat  Menemukan teknik sekuensing DNA yang memungkinkan seseorang dapat mensekuensing ribuan urutan pasangan basa DNA dalam waktu setahun. Sejak pertengahan tahun 1980-an, metode Sanger menjadi lebih umum digunakan. Pada tahun 1986, tim Leroy Hood di California Institute of Technology dan Applied Biosystems berhasil membuat mesin Sequencing DNA automatis berdasarkan metode Sanger.

B.     Proses

Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap. Tahapan dari metode Maxam-Gilbert yaitu molekul DNA ditandai dengan radioaktif terlebih dahulu, lalu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Selanjutnya basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

Gambar 3. Pembacaan Page dengan Metode Maxam-Gilbert

Metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam scale-up. Selanjutnya digunakan metode Sanger. Dalam metode Sanger diperlukan:

1.      DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA.

2.      Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi.

3.      DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template.

4.      Sejumlah nukeotida normal.

5.      Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent).

6.      Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan).

7.      Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti.

8.      Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi , masing-masing berhenti pada DDnukleotida tertentu yang dilabel. Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.

Tahapan sekuensing yang pertama adalah menyediakan dsDNA (double strand DNA). Lalu memotong dsDNA (double strand DNA) menjadi ssDNA (single strand DNA). Setelah terpotong diambil  template (cetakan) DNA dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA tadi. Setelah itu seluruh alat dan bahan untuk sekuensing DNA. Bahan untuk sekuensing adalah template (cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym polymerase. Reaksi ini terjadi didalam tabung sehingga disiapkan  4 tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi diberikan ddNTP, yaitu ddGTP, ddCTP, ddATP, dan ddTTP. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan ddNTP yang berbeda. Setelah masing-masing tabung diisi dengan ddNTP, kemudian masing-masing tabung diisi dengan dNTP, Yaitu dGTP, dCTP, dATP, dan dTTP. Dimasukan juga dNTP, primer, dan enzim polimerase ke dalam tabung reaksi tadi. Enzim polymerase terus mengkatalisis pembentukan polinukleotida dari nukleotida dNTP (deoksi nukleotida tri phospat). Pada saat enzim taq-polymerase mengkatalisis pembentukan ikatan antara nukleotida, deoksi-nukleotida (ddNTP) hadir berikatan dengan polimer nukleotida sebelumnya. Kehadiran ddNTP (deoksinukleotida) mengakibatkan terhentinya/terminasi proses polimerase, sehingga dihasilkan rantai polinukleotida yang berbeda panjangnya. Perbedaan panjang polinukleotida tersebut, mengakibatkan perbedaan letak pada gel agarosa. Polinukleotida yang paling pendek bermigrasi/pergerakannya paling cepat pada gel agarosa.

C.    Aplikasi

Aplikasi dari restriksi dan sekuensing DNA terdapat dalam hal pemuliaan tanaman, perlindungan tanaman, genetika, bioteknologi, biologi molekuler, ,genomika.pemuliaan hewan ternak, morfologi anatomi hewan, dan studi penyakit genetic. Dalam hal pemuliaan tanaman dapat dilakukan  pemanfaatan teknologi sekuensing genom untuk mempercepat program pemuliaan tanaman. Sampai saat ini, 39 spesies tanaman telah memiliki peta genom acuan. Dengan adanya peta genom acuan memungkinkan peneliti melakukan resekuensing untuk memahami secara lebih baik susunan genom individu koleksi SDG. Membantu mempercepat penemuan berbagai variasi genetik untuk mendukung program pemuliaan tanaman secara terarah, cepat, dan akurat menggunakan metode pemuliaan tanaman berbasis data genom.

Selain itu ada juga teknologi NGS. Filosofi dasar teknologi ini diadaptasi dari metode sekuensing shotgun dan untuk mendeskripsikan semua teknologi sekuensing selain teknologi sekuensing Sanger. Dengan teknologi ini membuat biaya sekuensing genom menjadi murah sehingga memungkinkan melakukan sekuensing lebih banyak genom spesies tanaman dengan biaya yang terjangkau. Spesies tanaman yang telah memiliki peta genom acuan dan diselesaikan menggunakan teknologi NGS, yaitu:

Mentimun (Cucumis sativus)

Apel (Malus domestica)

Stroberi hutan (Fragaria vesca)

Kakao (Theobroma cacao)

Kedelai liar (Glycine soja)

Jarak pagar (Jatropha curcas)

Date palm (Phoenix dactylifera)

Kentang (Solanum tuberosum)

Thellungella (Thellungella parvula)

Sawi China (Brassica rapa)

Indian hemp (Canabis sativa)