CLONING

 CLONING

A.    Pengantar

Kloning berasal dari kata “clone” dan berasal dari bahasa Yunani yaitu klon yang berarti potongan yang digunakan untuk memperbanyak tanaman. Sedangkan Encyclopedia Britannica menyebutkan clone (whole organism cloning) sebagai organisme individual yang tumbuh dari satu sel tubuh tunggal orang tuanya yang secara genetik identik. Dalam ilmu biologi kloning adalah proses untuk menghasilkan populasi individu yang identik secara genetik, yang terjadi di alam ketika organisme seperti bakteri, insekta, atau tumbuhan bereproduksi secara aseksual.

Ada tiga jenis kloning, yaitu kloning molekul, kloning sel, dan kloning organisme. Kloning molekul atau kloning gen adalah pembentukan sekelompok salinan gen yang bersifat identik, yang direplikasi dari satu gen yang dimasukkan ke dalam sel inang. Kloning DNA bertujuan menghasilkan sejumlah besar DNA yang identik, termasuk gen, promotor, sekuens non-coding, dan fragmen DNA, untuk penelitian lanjut atau menggunakan DNA pada organisme yang intak untuk menghasilkan protein yang bermanfaat baik bagi penelitian maupun kemajuan di bidang kesehatan. Kloning sel yaitu pembentukan sekelompok sel yang identik sifat-sifat genetiknya, semua berasal dari satu sel, seperti dalam hal galur imunosit yang diprogram untuk menghasilkan suatu jenis antibody.

Pada akhir tahun 1960, para ilmuwan sangat tertarik dengan teknik kloning, mereka beranggapan bahwa sangat memungkinkan untuk melakukan kloning DNA dengan cara memotong dan menginsersikan gen tertentu dari berbagai sumber organisme yang berbeda (teknologi DNA rekombinan). Pengkloningan gen bertujuan untuk: (a) menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut, (b) menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut, (c) mempelajarai fungsi RNA/ protein/ enzim yang disandi gen tersebut, (d) mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan, (e) merekayasa organisme untuk tujuan tertentu misalnya memproduksi insulin. Untuk mengklon gen, diperlukan DNA yang dapat berasal dari DN kromosom, cDNA (complementary DNA yang disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template), dan DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR.

B.     Proses Kloning

Gambar 1. Tahapan Kloning

 

Terdapat 4 tahapan dalam kloning sebagai berikut:

1.      Isolasi vektor dan sumber DNA,

Gambar 2. Plasmid dalam bakteri

Tekniknya secara umum antara lain lisis sel (menghancurkan dinding sel), ekstraksi (mengekstrak yang terkandung dalam sel), dan purifikasi (pemurnian DNA yang akan diambil). Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk membawa molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid adalah DNA ekstrakromosom yang dapat berinteraksi secara autonom. Plasmid berbentuk DNA sirkular yakni adalah salah satu bahan genetik bakteri yang berupa untaian DNA berbentuk lingkaran kecil. Plasmid memiliki keunikan yakni dapat  keluar-masuk ‘tubuh’ bakteri, dan bahkan sering dipertukarkan antar bakteri.

2.      Memasukan DNA rekombinan ke dalam bakteri

Menanamkan plasmid rekombinan ke dalam bakteri atau yang disebut sebagai host (sel inang). Namun sebelum dimasukan ke dalam bakteri plasmid rekombinan dipastikan terlebih dahulu sudah terligasi dengan baik menggunakan teknik elektroforensis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi.

3.      Mengkloning dengan menggembangbiakan bakteri

Pada tahap ini antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.  Cara seleksi sel transforman akan pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu : (a) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (b) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (c) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.

4.      Seleksi kloning sel

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni. Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.

C.    Aplikasi Kloning

Ada beberapa aplikasi dari kloning gen diantaranya adalah:

1.      Ponicillium chrysogenum ke dalam Plasmid Ppicza untuk Pengembangan Produksi Penisilin G

Tujuannya adalah untuk memperoleh rekombinan berupa fragmen gen pcbC yang disisipkan ke dalam Plasmid pPICZA. Metode yang digunakan antara lain:

a.       Amplifikasi fragmen gen pcbC

b.      Isolasi dan digesti DNA plasmid pPICZA dari E.coli

c.       Kloning gen pcbC yang dilakukan secara bertahap yaitu ligasi pada plasmid vektor, transformasi pada E.coli, dan seleksi rekombinan yang membawa plasmid sisipan

d.      Verifikasi hasil kloning

e.       Sekuensing dan analisis sekuen.

2.      Kloning Gen Virulen Streptococcus agalactiae sebagai bahan dasar vaksin rekombinan.

Tujuannya adalah untuk melakukan kloning gen virulen bakteri Streptococcus agalactiae isolat lokal untuk mendukung pengembangan vaksin DNA. Metode yang digunakan antara lain:

a.       Isolasi bakteri dan genom DNA Streptococcus agalactiae

b.      Desain primer gen virulen

c.       Isolasi dan kloning gen mga

d.      Isolasi plasmid

e.       Analisis sekuen gen mga

f.       Kloning gen mga ke vektor pMBA

3.      Kloning Gen Melanoma Antigen 1 (Mage-1) dari Jaringan Testis untuk Mendapatkan Plasmid Rekombinan Mage-1

Tujuannya adalah untuk mengkloning area koding gen Mage-1 dari jaringan testis pada vektor serta untuk mendapatkan plamid rekombinan Mage-1. Metode yang digunakan antara lain:

a.         Isolasi pada seluruh area koding gen Mage-1 dilakukan dengan teknik semi nested polymerase chain reaction (PCR).

b.        Hasil PCR itu dianalisis dengan gel elektroforesis pada gel agarose 2% yang mengandung ethidium bromide, setelahitu divisualisasikan mempergunakan ultraviolet (UV) transluminator. Produk PCR kemudian dipurifikasi untuk persiapan kloning.

c.         Campuran reaksi diinkubasi dalam es selama 5 menit, kemudian langsung ditransformasikan ke Escherichia coli (E. coli) Capture Audience Attention.

d.        Isolasi plasmid dilakukan dari hasil kultivikasi memakai high speed plasmid mini kit (Geneaid).

e.         Analisis plasmid rekombinan pETGM/Mage 1-testis dilakukan dengan cara analisis sekuens nukleotida dari DNA target yang terdapat pada plasmid untuk mengetahui keberhasilan kloning.

4.      Pengkloningan Gen Penyandi Viral Protein 15 (VP-15) WSSV dan Aplikasinya Sebagai Vaksin Rekombinan Pada Udang Windu

Tujuannya adalah untuk mengisolasi dan merekombinasikan gen penyandi VP-15 dari WSSV sebagai vaksin dsRNA. Metode yang digunakan antara lain:

a.       Koleksi Sampel dan Ekstraksi Genomik DNA

b.      Deteksi Penyakit Bintik Putih

c.       Isolasi Gen VP-15 WSSV

d.      Produksi Vaksin Rekombinan dsRNA VP-15

e.       Isolasi dan Konstruksi Gen VP-15 dengan Promoter T7

f.       Pengklonan Gen Penyandi VP-15

g.      Aplikasi Vaksin Rekombinan dsRNA pada Udang Windu