Southern Blotting
A.
Pendahuluan
Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, atau protein ke
dalam lembaran tipis/membran menggunakan proses elektroforesis gel.
Secara umum teknik ini dibagi menjadi empat yaitu southern blotting, northern blotting,
western blotting, dan easrtern blotting. Perbedaan dari empat macam teknik
tersebut adalah apabila southern blotting digunakan untuk mendeteksi molekul
DNA, nortern blotting untuk mendeteksi molekul RNA, western blotting untuk
mendeteksi protein, dan eastern blotting untuk mendeteksi karbohidrat dan
lemak.
Southern blotting adalah metode yang digunakan dalam
biologi molekuler untuk mendeteksi urutan DNA spesifik dalam suatu sampel DNA. Metode ini ditemukan
oleh seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama Edward M. Southern, yang
mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas Edinburgh. Metode ini
mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk memisahkan DNA berdasarkan
ukurannya dan kemudian ditransfer ke membran filter untuk selanjutnya dilakukan
hibridisasi dengan probe. Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen
DNA spesifik, diperlukan suatu pelacak (probe). DNA dipisahkan terlebih dahulu
dengan elektroforesis. Probe yang dilabel akan hibridisasi pada pita-pita DNA
untuk mengetahui apakah DNA tersebut mengandung gen yang diinginkan. Blot
Southern mendeteksi DNA rantai tunggal dengan menggunakan DNA sebagai pelacak.
Prinsip dari southern blotting adalah kapilaritas,
dimana bufer yang merupakan fase gerak diasumsikan akan membawa fragmen DNA
dari gel ke membran. Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran positif
maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran. Membran yang digunakan pada
proses blot southern adalah membran nitroselulosa. Kunci dari metode ini adalah
hibridisasi dimana proses
pembentukan molekul DNA untai ganda antara probe DNA untai tunggal dan
target DNA untai tunggal.
Komponen utama dari southern blotting terdiri atas DNA
yaitu materi yang akan diidentifikasi, enzim restriksi yang berguna untuk memotong DNA menjadi fragmen-fragmen tertentu,
DNA probe yaitu fragmen DNA
sebagai pelacak gen, membran nitroselulosa yang digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen DNA dari
gel agarosa, larutan buffer untuk membawa DNA dari gel dan meng-imobilisasi DNA pada
membran,
dan detector yang digunakan untuk melihat
(mem-visualisasi) pola hibridisasi.
B.
Proses
Tahap awal dari southern blotting adalah Isolasi
DNA.Isolasi DNA adalah suatu proses
pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain di inti sel. Terdapat tiga
tahapan dasar dan dua tahapan tambahan dalam prosedur isolasi DNA ini, yaitu
preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran sel), purifikasi
DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan
protease) dan RNA (dengan RNAse). Teknik ini diawali dengan perusakan
dinding sel. Pemecahan dinding sel dapat
dilakukan secara kimiawi, misalnya dengan menggunakan enzim lisozim, etilen
diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya. Pada kondisi tertentu
pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan lisozim dan EDTA, akan tetapi
sering ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan dinding sel antara lain
deterjen triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Setelah sel mengalami
lisis, tahap selanjutnya adalah memisahkan debris sel dengan cara sentrifugasi.
Komponen sel yang tidak larut diendapkan dengan sentrifugasi sehingga
meninggalkan ekstrak sel dalam supernatan yang jernih
Proses selanjutnya adalah
pemurnian (purifikasi) DNA. Proses ini bertujuan
untuk menghilangkan beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder
(fenol), polisakarida, RNA dan juga protein. Pemurnian dari
kontaminan protein dan RNA dilakukan menggunakan senyawa kloroform isoamilalkohol,
asam asetat, dan enzim RNAse. Senyawa kloroform isoamilalkohol dan asam asetat
berfungsi mendenaturasi protein sedangkan enzim RNAse berfungsi melisiskan RNA
dari ekstrak DNA tersebut. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian
dilakukan presipitasi (pemekatan) dengan cara “presipitasi etanol”.
Tahapan kedua dari southern blotting adalah
pemotongan dengan enzim restriksi. DNA hasil dari proses isolasi kemudian
dipotong menggunakan enzim restriksi endonuklease tertentu yang dipilih dengan
hati-hati. Hasil dari pemotongan DNA akan terbentuk fragmen-fragmen DNA yang
lebih kecil.
Tahapan ketiga adalah elektroforesis. Elektroforesis
digunakan untuk memisahkan fragmen sesuai dengan ukuran. Fragmen-fragmen yang
diperoleh dari hasil pemotongan DNA selanjutnya dipisahkan oleh elektroforesis
pada gel Gel yang biasa digunakan adalah
agarosa. Gel agarosa adalah suatu polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis
ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan separasi DNA dengan
kisaran ukuran yang luas. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel
DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb).
Tahap keempat yaitu denaturasi yaitu memindahkan fragmen restriksi yang terdapat dalam gel, didenaturasi
menggunakan alkali. Proses ini mengakibatkan untai ganda DNA berubah menjadi
untai tunggal seperti yang terlihat pada gambar di bawah ini.
Tahap kelima adalah memindahkan DNA ke membrane
nitroselulosa. Fungsi dari memindah DNA dari gel ke membrane untuk membuat
replica (blot), membrane biasanya terbuat dari nilon atau nitroselulosa.
Pengikatan nilon (500 μg/cm) lebih banyak dibandingkan nitroselulosa (100
μg/cm). Nitroselulosa ideal untuk blotting protein dan asam nukleat. Setelah
DNA dipindahkan ke membrane, untuk membuatnya menempel maka dapat dilakukan
dengan cara pengeringan pada suhu sekitar 80℃ dan menyinari dengan sinar UV.
Tahap keenam yaitu menambah label probe untuk hibridisasi. Hal ini dapat
dilakukan dengan cara menginkubasi filter di bawah kondisi hibridisasi dengan
DNA probe yang dilabeli secara spesifik. Selanjutnya Pelabelan dapat dilakukan
dengan 2 metode, yaitu dengan bahan bersifat radioaktif (32P) ata non
radioaktif (Biotin). Probe digunakan untuk mengidentifikasi fragmen DNA yang
tertarik atau mendeteksi target yang spesifik. Probe dihibridisasi (kawin
silang) dengan fragmen komplemen DNA.
Tahap ketujuh adalah pencucian. Probe yang berlebih
akan terikat secara tidak spesifik pada membrane. Membran diinkubasi dengan
larutan pencuci buffer yang mengandung NaCl untuk membuang kelebihan probe.
Untuk tahap yang terakhir adalah autoradiografi. Jika probe bersifat
radioaktif, partikel akan dipancarkan ketika terekspos pada film X-ray dengan
autoradiograf. Deteksi biotin / streptavidin dilakukan dengan metode
kolorimetri, dan visualisasi bioluminescent menggunakan luminesence. Akan ada
bagian atau titik yang gelap pada film ketika probe terikat. Secara umum proses
dari southern blotting dapat dilihat pada gambar di bawah ini:
C.
Aplikasi
Aplikasi dari southern blotting banyak digunakan
dalam bidang kesehatan dan bidang rekayasa genetika. Dalam bidang
kesehatan studi pengembangan, uji
forensik dan diagnostic dapat dilakukan dengan southern blotting. Southern blots digunakan untuk penemuan,
pemetaan, dan evolusi dari suatu gen. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi
pada organisme, Southern blot digunakan sebagai test untuk memastikan bahwa
bagian DNA tertentu mengenal urutan gen.
Pada tanaman, aplikasi southern blotting dilakukan
pada rekayasa genetic. Dalam jurnal terdapat contoh rekayasa genetic yang digunakan dalan
tanaman. Salah satunya yaitu perakitan
tanaman transgenic tahan hama. Perakitan ini umumnya mempergunakan gen dari
Bacillus thuringien- sis (Bt). Pada tahun 1995, tanaman transgenik pertama
mulai tersedia bagi petani di Amerika Serikat, yaitu jagung hibrida yang
mengandung gen cry IA(b), Maximizer, yang dibuat oleh Novartis, tanaman kapas
yang mengandung gen cry IA(c), Bollgard, dan kentang yang mengandung gen cry
3A, Newleaf, yang dibuat oleh Monsanto. Konfirmasi keberadaan transgen serta
kestabilannya dapat dilakukan dengan polymerase chain reaction (PCR) dan
Southern-blot. Perbedaan dari keduanya adalah PCR hanya dapat menginformasikan
ada atau tidaknya sekuen transgen sesuai dengan primer yang dipakai, sedangkan
untuk mengetahui apakah seluruh basa yang ada dalam transgen ter- integrasi
dalam genom tanaman perlu dilakukan Southern-blot. Southern blot juga dapat
menginformasikan jumlah copy gen yang terintegrasi dan pengaturan kembali pada
transgen setelah terintegrasi dalam genom tanaman.