Restriction Site DNA Sequencing

Restriction Site DNA Sequencing

A.    Pengantar

Enzim Restriksi

Enzim restriksi merupakan enzim yang dapat memotong molekul DNA pada sekuens spesifik yang pangjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa. Kerja enzim dalam tubuh inangnya adalah mengenali dan memotong DNA (termasuk DNA faga tertentu) yang asing bagi bakteri tersebut. Hal ini dilakukan sebagai mekanisme perlindungan bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain seperti virus atau sel bakteri lain. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong DNA pada lokasi-lokasi yang spesifik mengenali daerah atau urutan DNA pendek dalam molekul DNA dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat PALINDROME.

Selanjutnya enzim tersebut akan memotong DNA pada titik tertentu di dalam urutan DNA tersebut. Sel bakteri ini melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan menambahkan gugus metil (CH₃) pada adenine atau sitosindi dalam urutan yang dikenali oleh enzim restriksi. Enzim-enzim restriksi yang telah ditemukan dan telah tersedia secara komersial telah berjumlah ratusan. Ada tiga tipe enzim restriksi yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan. Hasil pemotongan enzim restriksi ada dua jenis. Hasil pemotongan yang menghasilkan ujung tumpul atau “Blunt end” dan hasil pemotongan yang menghasilkan ujung lancip/ lengket atau “Sticky end”.

Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi

endonuklease tipe I, II dan III

Salah satu contoh enzim restriksi adalah EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalagh GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Beberapa contoh enzim restriksi endonuklease dapat dilihat pada tabel di bawah ini.

Gambar 2. Macam-macam enzim restriksi endonuclease

Sekuensing DNA

Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik untuk menentukan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Sekuens DNA merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sejarah sekuensing DNA pada mulanya dilakukan dengan mentranskripsikannya ke dalam bentuk RNA terlebih dahulu karena metode Sequencing RNA telah ditemukan sebelumnya. Pada tahun 1965, Robert Holley dan timnya dari Cornell University di New York, Amerika Serikat, mempublikasikan sekuens tRNA alanin dari khamir yang terdiri atas 77 nukleotida. Sequencing tRNA tersebut membutuhkan waktu 7 tahun dan hasilnya merupakan sekuens molekul asam nukleat yang pertama kali dipublikasikan. Sekuens DNA yang pertama kali dipublikasikan adalah DNA sepanjang 12 nukleotida dari suatu virus, yaitu bakteriofag lambda, pada tahun 1971, yang ditentukan dengan cara serupa oleh Ray Wu dan Ellen Taylor, keduanya juga dari Cornell University.

Pada tahun 1975, Frederick Sanger dan Alan Coulson dari laboratorium biologi molekular Medical Research Council Inggris di Cambridge mempublikasikan metode Sequencing DNA secara langsung yang disebut teknik plus–minus. Pada tahun 1977  Allan Maxam dan Walter Gilbert di Amerika Serikat  Menemukan teknik sekuensing DNA yang memungkinkan seseorang dapat mensekuensing ribuan urutan pasangan basa DNA dalam waktu setahun. Sejak pertengahan tahun 1980-an, metode Sanger menjadi lebih umum digunakan. Pada tahun 1986, tim Leroy Hood di California Institute of Technology dan Applied Biosystems berhasil membuat mesin Sequencing DNA automatis berdasarkan metode Sanger.

B.     Proses

Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap. Tahapan dari metode Maxam-Gilbert yaitu molekul DNA ditandai dengan radioaktif terlebih dahulu, lalu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Selanjutnya basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

Gambar 3. Pembacaan Page dengan Metode Maxam-Gilbert

Metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam scale-up. Selanjutnya digunakan metode Sanger. Dalam metode Sanger diperlukan:

1.      DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA.

2.      Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi.

3.      DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template.

4.      Sejumlah nukeotida normal.

5.      Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent).

6.      Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan).

7.      Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti.

8.      Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi , masing-masing berhenti pada DDnukleotida tertentu yang dilabel. Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.

Tahapan sekuensing yang pertama adalah menyediakan dsDNA (double strand DNA). Lalu memotong dsDNA (double strand DNA) menjadi ssDNA (single strand DNA). Setelah terpotong diambil  template (cetakan) DNA dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA tadi. Setelah itu seluruh alat dan bahan untuk sekuensing DNA. Bahan untuk sekuensing adalah template (cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym polymerase. Reaksi ini terjadi didalam tabung sehingga disiapkan  4 tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi diberikan ddNTP, yaitu ddGTP, ddCTP, ddATP, dan ddTTP. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan ddNTP yang berbeda. Setelah masing-masing tabung diisi dengan ddNTP, kemudian masing-masing tabung diisi dengan dNTP, Yaitu dGTP, dCTP, dATP, dan dTTP. Dimasukan juga dNTP, primer, dan enzim polimerase ke dalam tabung reaksi tadi. Enzim polymerase terus mengkatalisis pembentukan polinukleotida dari nukleotida dNTP (deoksi nukleotida tri phospat). Pada saat enzim taq-polymerase mengkatalisis pembentukan ikatan antara nukleotida, deoksi-nukleotida (ddNTP) hadir berikatan dengan polimer nukleotida sebelumnya. Kehadiran ddNTP (deoksinukleotida) mengakibatkan terhentinya/terminasi proses polimerase, sehingga dihasilkan rantai polinukleotida yang berbeda panjangnya. Perbedaan panjang polinukleotida tersebut, mengakibatkan perbedaan letak pada gel agarosa. Polinukleotida yang paling pendek bermigrasi/pergerakannya paling cepat pada gel agarosa.

C.    Aplikasi

Aplikasi dari restriksi dan sekuensing DNA terdapat dalam hal pemuliaan tanaman, perlindungan tanaman, genetika, bioteknologi, biologi molekuler, ,genomika.pemuliaan hewan ternak, morfologi anatomi hewan, dan studi penyakit genetic. Dalam hal pemuliaan tanaman dapat dilakukan  pemanfaatan teknologi sekuensing genom untuk mempercepat program pemuliaan tanaman. Sampai saat ini, 39 spesies tanaman telah memiliki peta genom acuan. Dengan adanya peta genom acuan memungkinkan peneliti melakukan resekuensing untuk memahami secara lebih baik susunan genom individu koleksi SDG. Membantu mempercepat penemuan berbagai variasi genetik untuk mendukung program pemuliaan tanaman secara terarah, cepat, dan akurat menggunakan metode pemuliaan tanaman berbasis data genom.

Selain itu ada juga teknologi NGS. Filosofi dasar teknologi ini diadaptasi dari metode sekuensing shotgun dan untuk mendeskripsikan semua teknologi sekuensing selain teknologi sekuensing Sanger. Dengan teknologi ini membuat biaya sekuensing genom menjadi murah sehingga memungkinkan melakukan sekuensing lebih banyak genom spesies tanaman dengan biaya yang terjangkau. Spesies tanaman yang telah memiliki peta genom acuan dan diselesaikan menggunakan teknologi NGS, yaitu:

Mentimun (Cucumis sativus)

Apel (Malus domestica)

Stroberi hutan (Fragaria vesca)

Kakao (Theobroma cacao)

Kedelai liar (Glycine soja)

Jarak pagar (Jatropha curcas)

Date palm (Phoenix dactylifera)

Kentang (Solanum tuberosum)

Thellungella (Thellungella parvula)

Sawi China (Brassica rapa)

Indian hemp (Canabis sativa)

STUKTUR GEN

STUKTUR GEN

A.    Pengantar Struktur Gen

Genetika merupakan ilmu yang mempelajari tentang sifat keturunan. Dalam ilmu biologi, genetika merupakan ilmu yang mempelajari tentang gen, pewarisan sifat, dan keanekaragaman organisme hidup. Istilah “genetika” berasal dari bahasa Yunani genetikos atau genesis yang berarti “asal”. Imu genetika berawal dari penemuan Gregor Mendel tentang ciri-ciri faktor keturunan yang ditentukan oleh suatu unit dasar yang diwariskan dari generasi ke generasi yang disebut unit genetik atau gen. Gen adalah bahan yang diwariskan dari generasi ke generasi dan keturunannya mempunyai persamaan fisik dengan materi tersebut serta membawa informasi yang berkaitan dengan struktur, fungsi, dan sifat-sifat biologi yang lain.

Gambar 1. Pewarisan sifat tumbuhan

Gregor Johann Mendel pada abad ke-19 melakukan sebuah penelitian tentang pewarisan sifat pada tumbuhan. Mendel berspekulasi tentang adanya suatu bahan yang terkait dengan suatu sifat atau karakter di dalam tubuh suatu individu dan dapat diwariskan. Dia menyebut hal tersebuat sebagai “faktor”. Ada beberapa materi genetik diantaranya adalah DNA, RNA, kromosom, dan gen. DNA (deoxyribonucleic acid) adalah satuan unit fungsional penyimpan kode gen (genom) yang terdapat dalam nukleus. Watson-Crick mengungkapkan bahwa struktur DNA berupa heliks-ganda antiparalel (double-helix antiparallel) yang berarti pita yang terdiri dari rantai ganda yang berlawanan sejajar. DNA tersusun atas nukleotida sehingga dapat disebut polinukleotida. Nukleotida adalah struktur pembentuk DNA yang terdiri atas satu gugus fosfat, satu gula pentosa, satu basa nitrogen.

RNA (ribonucleic acid) adalah satuan unit fungsional penyalur kode gen (genom) yang bersal dari DNA. Struktur RNA berupa pita yang terdiri dari rantai tunggal. RNA tersusun atas ribonukleotida, namun tetap disebut polinukleotida. Sedangkan ribonukleotida tanpa gugus fosfat disebut ribonukleosida. Perbedaan DNA dan RNA dipaparkan pada Tabel 1 berikut:

Tabel 1. Perbedaan DNA dan RNA

Pembeda	DNA	RNA
Letak	Nukleus, mitokondria, kloroplas	Nukleus, ribosom, sitoplasma
Rantai	Ganda, panjang	Tunggal, pendek
Fungsi	Hereditas, sintesis protein	Sintesis protein
Gula pentosa	2-deoksiribosa	Ribosa
Basa nitrogen	A=T dan G=C Dikenal basa timin (T)	A=U dan G=C Dikenal basa urasil (U)
Kadar	Tetap	Berubah-ubah
Jenis	DNA sense (kodogen) dan anti-sense	mRNA, rRNA, tRNA

Gambar 3. Kromosom

Kromosom adalah struktur di dalam sel berupa deretan panjang molekul yang terdiri dari satu molekul DNA dan berbagai protein terkait yang merupakan informasi genetik suatu organisme.

Gambar 4. Gen

Gen adalah unit pewarisan sifat bagi organisme hidup. Gen merupakan partikel paling kecil yang terdapat dalam kromosom, mengandung informasi genetik. Tiap gen mempunyai tugas dan fungsi yang berbeda. Pada waktu pembelahan mitosis dan meiosis dapat terjadi proses duplikasi. Struktur gen terdiri dari promoter, operator, daerah pengkode, dan termonator.

Promoter adalah urutan DNA spesifik yang berperan dalam mengendalikan transkripsi gen struktural. Terletak di daerah upstream (hulu) dari bagian struktural gen. Berfungsi sebagai  tempat awal pelekatan enzim RNA polimerase yang nantinya melakukan transkripsi pada bagian struktural. Operator merupakan urutan nukelotida yang terletak di antara promotor dan bagian struktural dan merupakan tempat pelekatan protein represor (penekan atau penghambat ekspresi gen). Daerah pengkode merupakan Ekson dan intron yang mengkode RNA atau protein. Sedangkan, terminator bagian dari gen yang berperan dalam proses penghentian transkripsi.

Gambar 5. Struktur Gen

 

B.     Proses Struktur Gen

Gambar 6. Intron dan Ekson

Perbedaan struktur gen Prokariotik dan Eukariotik terletak pada bagian pengkode. Bagian pengkode pada prokariotik terdapat bagian intron yang tidak dapat diekspresikan sehingga semuanya ekson, kecuali pada Archaebacteria dan Bakteriofag ada yang memiliki intron. Sedangkan bagian pengkode pada Eukariotik terdiri dari ekson dan intron. Intron adalah sekuens nukleotida yang tidak akan ditemukan “terjemahannya” di dalam rangkaian asam amino protein yang dikode oleh suatu gen. Ekson adalah sekuens nukleotida yang akan diterjemahkan. Ekson nantinya akan ditranskripsikan menjadi mRNA, sedangkan intron yang terletak di antara ekson harus dipotong agar tercipta mRNA yang runtut.

Gambar 7. Proses Splicing

Gen yang mengandung intron akan ditranskripsikan menjadi pre-mRNA yang harus menjalani splicing agar terbentuk mRNA matang. Proses splicing membutuhkan bantuan dari snRNA (small nuclear RNA) dan suatu protein membentuk kompleks protein small ribonuclear proteins (snRNPs, dibaca “snurp”) yang terdiri dari U1,U2, U4, U5, dan U6. Sinyal-sinyal pada ujung 5′, 3′, dan branchpoint sequence akan displicing oleh snRNA (small nuclear RNA) yang berasosiasi dengan snurp. Snurp U1 akan mengenali dan mengikat ujung 5′ dari intron; snurp U2 akan mengikat branchpoint sequence; snurp U2AF (U2 accesore factor) akan mengikat ujung 3′; dan snurp U4/U6 akan mengikat snurp U2 dan U6. Kompleks antara snRNPs dengan pre-mRNA akan membentuk suatu kompleks yang dinamakan spilceosome. Spliceosome akan membentuk gulungan (loop) pada intron dan selanjutnya intron dipotong.

C.    Aplikasi dari Struktur Gen

Struktur gen diaplikasikan pada beberapa bidang diantaranya bidang medis (produk farmasi, diagnosa penyakit, pengobatan penyakit genetik, vaksin subunit rekombinan), bidang pertanian (hewan ternak, tumbuhan, dan bakteri), forensik, dan lingkungan. Aplikasi untuk diagnosa penyakit dilakukan untuk mendiagnosis penyakit genetik seperti buta warna dan hemofilia. Teknik yang digunakan adalah teknik hibridasi yaitu teknik berdasarkan kemampuan urutan asam nukleat yang komplemen untuk dapat berikatan satu sama lain. Pengobatan penyakit genetik dapat dilakukan melalui terapi gen. Terapi gen merupakan keadaan ketika DNA dimasukkan ke pasien untuk mengobati penyakit genetik. DNA baru biasanya mengandung gen yang berfungsi untuk memperbaiki efek mutase penyebab penyakit. Terapi gen menggunakan bagian DNA untuk mengobati atau mencegah penyakit. DNA yang akan digunakan dipilih secara hati-hati untuk mengoreksi efek gen yang bermutasi penyebab penyakit. Teknik terapi gen awal mulanya dikembangkan pada tahun 1972, tetap sejauh ini mempunyai keberhasilan yang terbatas dalam mengobati penyakit pada mausia.

Jenis terapi gen ada terapi gen somatik dan terapi gen germline. Terapi gen somatik adalah transfer bagian DNA ke sel tubuh yang tidak menghasilan sperma atau telur, sedangkan terapi gen germline merupakan transfer bagian DNA ke sel-sel yang menghasilkan telur atau sperma. Selain jenis terapi gen, terdapat pula teknik terapi gen, meliputi terapi augmentasi gen, terapi penghambatan gen, dan killing of specific cells. Terapi gen juga dapat menyembuhkan beberapa penyakit diantaranya kekurangan  kekebalan tubuh (immune deficiencies), penyakit darah (blood deseases), gangguan metabolisme lemak (fat metabolism disorder), kanker, dan penyakit parkinson (parkinson’s disease).

Gambar 8. Terapi augmentasi gen

Gambar 9. Terapi pemhambatan gen

Gambar 10. Terapi gen dengan membunuh sel tertentu

Terapi augmentasi gen digunakan untuk mengobati penyakit yang disebabkan oleh mutasi yang menghentikan gen dari fungsinya menghasilkan produk tertentu, seperti protein. Terapi ini menambahkan DNA yang mengandung versi fungsional dari gen yang hilang kembali ke dalam sel. Gen baru menghasilkan proHanya berhasil jika efek penyakitnya dapat dibalik atau tidak mengakibatkan kerusakan permanen pada tubuhduk yang berfungsi pada tingkat yang cukup untuk menggantikan protein yang semula hilang. Terapi penghambatan gen cocok untuk pengobatan penyakit infeksi, kanker dan penyakit warisan yang disebabkan oleh aktivitas gen yang tidak sesuai. Bertujuan untuk memperkenalkan gen yang produknya: menghambat ekspresi gen lain & mengganggu aktivitas produk gen lain. Dasar terapi ini adalah untuk menghilangkan aktivitas gen yang mendorong pertumbuhan sel terkait penyakit. Killing specific cells bertujuan memasukkan DNA ke dalam sel yang sakit yang menyebabkan sel itu mati. DNA yang dimasukkan ditargetkan secara tepat untuk menghindari kematian sel yang berfungsi normal.